MRG6180104_full

รายงานวิจยัฉบบัสมบูรณ์ โครงการ การหาสารที่มีศกัยภาพในการยบัยงั้เอนไซมแ ์ อลฟากลโูคซิเดส และต้านอนุมลูอิสระจากต้นมะดนัรวมถึงการศึกษาเชิงจลนศาสตร์ ของเอนไซมแ ์ ละโมเลกลุลารด ์ อ ็ กกิ้งของสารที่มีฤทธ์ิ โดย อาจารย์ ดร.จีราพัสฐ์ สีแจ่ม เมษายน 2563สัญญาเลขที่ MRG6180104 รายงานวิจยัฉบบัสมบูรณ์ โครงการ การหาสารที่มีศกัยภาพในการยบัยงั้เอนไซมแ ์ อลฟากลโูคซิเดส และต้านอนุมลูอิสระจากต้นมะดนัรวมถึงการศึกษาเชิงจลนศาสตร์ ของเอนไซมแ ์ ละโมเลกลุลารด ์ อ ็ กกิ้งของสารที่มีฤทธ์ิ อาจารย ์ ดร.จีราพสัฐ ์ สีแจ่ม สาขาวิชาเคมีคณะวิทยาศาสตรแ ์ ละเทคโนโลยีมหาวิทยาลยัธรรมศาสตร ์ สนับสนุนโดยสา นักงานกองทุนสนับสนุนการวิจยัและมหาวิทยาลยัธรรมศาสตร ์ (ความเห็นในรายงานนี้เป็นของผู้วิจัย สกว. และมหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ไม่จ าเป็นต้องเป็นด้วยเสมอไป)กิตติกรรมประกาศ หัวหน้าโครงการวิจัยผู้รับทุนขอขอบพระคุณ ส านักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย (สกว.) และ มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ที่ได้สนับสนุนงบประมาณส าหรับด าเนิน โครงการการหาสารที่มีศักยภาพใน การยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสและต้านอนุมูลอิสระจากต้นมะดัน รวมถึงการศึกษาเชิงจลนศาสตร์ ของเอนไซมแ์ละโมเลกุลลารด์อ็กกง้ิของสารทม่ีฤีทธิ์(MRG6180104) ในครั้งนี้เป็นอย่างสูง และขอกราบ ขอบพระคุณ รองศาสตราจารย์ ดร.ปรีชา ภูวไพรศิริศาล อาจารย์ประจ าภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ที่ให้ค าปรึกษาจนโครงการวิจัยนี้ส าเร็จลุล่วงไปได้ด้วยดีบทคดัย่อ รหัสโครงการ: MRG6180104 ชื่อโครงการ: การหาสารที่มีศักยภาพในการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสและต้านอนุมูลอิสระจาก ต้นมะดัน รวมถึงการศึกษาเชิงจลนศาสตร์ของเอนไซมแ์ละโมเลกุลลารด์อ็กกง้ิของสารทม่ีฤีทธิ์ ชื่อนักวิจยั: ดร.จีราพัสฐ์ สีแจ่ม สาขาวิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์ อีเมล์: [email protected] ระยะเวลาโครงการ: 2 ปี บทคดัย่อ: จากผลของการคัดกรองฤทธยิ์บัยงั้เอนไซมแ์อลฟากลูโคซเิดสของสารสกัดหยาบจากส่วน ต่างๆ ของมะดันเบื้องต้น พบว่าสารสกัดจากเอทานอลจากเปลือกต้นและกิ่งมะดันมีศักยภาพในการ ยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสได้ดีโดยสามารถแยกสารใหม่ในกลุ่มไบฟลาโวนอยด์ที่มีชื่อว่า schomburgkixanthone (1) พร้อมด้วยสารที่มีรายงานมาแล้วอีก 21 ชนิด (2-22) จากเปลือกต้นและกิ่ง มะดัน ส าหรับโครงสร้างใหม่ของสาร 1 ได้พิสูจน์ทราบโดยใช้การวิเคราะห์ข้อมูลทาง NMR, IR, UV และ MS พร้อมกับการเปรียบเทียบกับรายงานก่อนหน้านี้ สาร 18 แสดงฤทธิต้านอนุมูลอิสระดีที่ ์สุด (IC50 49.64 ไมโครโมลาร์) และดีกว่าสารควบคุมเชิงบวก (วิตามินซี, IC50 198.7 ไมโครโมลาร์) ส่วนสาร 1 แสดงฤทธยิ์บัยงั้เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสจากยีสต์ได้ดีที่สุด (IC50 0.314 ไมโครโมลาร์) และดีกว่า สารควบคุมเชิงบวก (อะคาโบส, IC50 114.3 ไมโครโมลาร์) ในทางกลับกันสาร 3 (IC50 118.92 ไมโครโม ลาร์) และ 4 (IC50 135.36 ไมโครโมลาร์) แสดงฤทธิย์บัยงั้เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดจากล าไส้หนู (ซู เครส) ได้ต ่า จากการศึกษาเชิงจลนศาสตร์ของเอนไซม์ตามวิธีการของ Lineweaver-Burk plot พบว่า สาร 1 มีพฤติกรรมการยับยั้งเป็นตัวยับยั้งแบบผสม ส่วนการศึกษาเชิงจลนศาสตร์ของเอนไซม์และ โมเลกุลลาร์ ด็อกกิ้งของสาร 1 พบว่าหมู่ไฮดรอกซีฟีนอลิกบนวงแหวนฟีนิลที่ด็อกกิ้งเชื่อมโยงกับ บริเวณที่รับโปรตีนในสาร 1 ซึ่งป้องกันการซ ้าซ้อนของล าดับดีเอ็นเอ ท าให้สาร 1 สามารถเกิดการยับยั้ง ที่ดีกับเอนไซม์เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส ดังนั้นจากผลการทดลองที่ได้ในงานวิจัยนี้แสดงให้เห็นถึง ศักยภาพของมะดันส าหรับการใช้รักษาโรคเบาหวานในอนาคตได้และสารออกฤทธชนิด ิ์ ใหม่ (สาร 1) มี แนวโน้มที่จะใช้เป็นโมเลกุลที่สามารถบ าบัดโรคเบาหวานได้ ค าหลัก : มะดัน, schomburgkixanthone, ไบแซนโทน, สารต้านอนุมูลอิสระ, การยับยั้งเอนไซม์แอลฟา กลูโคซิเดส Abstract Project Code : MRG6180104 Project Title : Identification of potent α-glucosidase inhibitory and antioxidant constituents from Garcinia schomburgkiana, and the enzyme kinetic and molecular docking studies on active metabolites Investigator : Dr. Jirapast Sichaem, Department of Chemistry Faculty of Science and Technology Thammasat University E-mail Address : [email protected] Project Period : 2 years Abstract: Based on the results of primary screening of -glucosidase inhibition of Garcinia schomburgkiana crude extracts, the ethanol crude extracts of stem bark and twigs showed significant -glucosidase inhibition. A novel bixanthone, named schomburgkixanthone (1), along with 21 known compounds (2-22) were isolated from the stem bark and twigs of G. schomburgkiana. The novel structure of 1 was identified by the application of NMR, IR, UV and MS data analyses and comparison with previous reports. Compound 18 showed the highest antioxidant activity (IC50 49.64 M) and stronger than the positive compound (vitamin C, IC50 198.7 μM). Compound 1 exhibited the most potential yeast α-glucosidase activity (IC50 0.314 μM), which was superior to the positive control (acarbose, IC50 114.3 μM). On the other hand, compounds 3 (IC50 118.92 μM) and 4 (IC50 135.36 μM) revealed low inhibitory activity against rat intestinal -glucosidase (sucrase). The Lineweaver-Burk plots of a kinetic study indicated that 1 inhibited as a mixed mode inhibitor of -glucosidase. The molecular docking results highlighted the role of the phenolic hydroxyl groups on the phenyl rings linked to active sites of receptors of protein in 1 that prevented the duplication of DNA sequences so that the compound 1 made an excellent inhibitor against the α-glucosidase enzyme. These results suggest the potential of G. schomburgkiana for future application in the treatment of diabetes and a novel active compound 1 has emerged as a promising molecule for therapy. Keywords : Garcinia schomburgkiana, schomburgkixanthone, bixanthone, antioxidant, α-glucosidase inhibition1 บทสรปุผบู้ริหาร ที่มาและความส าคัญของปัญหา-ทบทวนวรรณกรรม การบ าบัดโรคเบาหวานนั้นมีอยู่หลากหลายวิธีด้วยกัน แต่วิธีการรักษาที่เป็นที่ยอมรับและมี ประสิทธิภาพกันมาก คือ การลดระดับน ้าตาลในเลือดหลังรับประทานอาหาร เพราะเมื่ออาหารเข้าสู่ ร่างกายแล้ว แป้งจะถูกเปลี่ยนเป็นโอลิโกแซคคาไรด์ที่มีขนาดเล็ก จากนั้นแอลฟากลูโคซิเดสจะท าหน้าที่ ย่อยโอลิโกแซคคาไรด์หรือไดแซคคาไรด์บริเวณปลายที่เป็นนอนรีดิวซิ่งชูก้า (non-reducing sugar terminal) ให้เป็นกลูโคสที่ล าไส้เล็กก่อนที่จะถูกดูดซึมเข้าสู่กระแสเลือด โดยกลไกการท างานของแอลฟา กลูโคซิเดสแสดงดังนี้ โดยแอลฟากลูโคซิเดส (EC 3.2.1.20) จัดเป็น glycoside hydrolase หรือตัวเร่งปฏิกิริยาใน กระบวนการไฮโดรไลสิส (กระบวนการสลายตัวของสารโดยอาศัยน ้า) ที่ต าแหน่ง -1,4 ซึ่งมีความ แตกต่างกับ -glucosidase (EC 3.2.1.21) ที่จะท าปฏิกิริยาตรงพันธะ -1,4 ซึ่งเป็นพันธะที่พบมาก ในเซลลูโลส ดังนั้นหากสามารถยับยั้งการท างานของแอลฟากลูโคซิเดสได้ จะท าให้การย่อยโอลิโกแซค คาไรด์เป็นกลูโคสได้ช้าลงและชะลอการเพิ่มของระดับน ้าตาลในเลือด นอกจากนี้สารยับยั้งเอนไซม์ แอลฟากลูโคซิเดสยังช่วยเพิ่มระดับอินซูลิน ลดไตรกลีเซอไรด์ และสามารถต้านการติดเชื้อจากไวรัส โรคมะเร็ง และเชื้อ HIV รวมถึงช่วยต้านโรคที่เกิดกับไลโซโซมได้อีกด้วย ส าหรบัยารกัษาโรคเบาหวานท่ีใช้ในปัจจุบันจะเป็นยาท่ีมีฤทธิใ์นการยบัยงั้การท างานของ แอลฟากลูโคซิเดส เช่น acarbose, voglibose และ miglitol ซึ่งได้มีการใช้ในการรักษาโรคเบาหวานกัน อย่างแพร่หลาย แต่ยากลุ่มดังกล่าวยังมีผลข้างเคียงคือ ท้องอืด ท้องเฟ้อ และท้องร่วง ส่งผลให้ปัจจุบัน หลายประเทศทั่วโลกหันมาสนใจในการค้นหาสารที่มีศักยภาพในการบ าบัดรักษาโรคเบาหวานชนิดใหม่ อยู่ตลอดเวลา 2 จากการศึกษารายงานวิจัยหลาย ๆ ฉบับ ที่ผ่านมาพบว่า สมุนไพรหลายชนิดมีศักยภาพในการ รักษาโรคเบาหวานได้เทียบเท่าหรือดีกว่ายาแผนปัจจุบัน ตัวอย่างสารเคมีส าคัญที่พบในสมุนไพร เหล่านั้น เช่น 1-deoxynojirimycin ซึ่งแยกได้จากพืชในวงศ์ Moraceae หรือสารในกลุ่ม thiosugar ได้แก่ salacinol และ kotalanol ซึ่งแยกได้จากพืช Salacia reticulata โดย salacinol มีรายงาน การศกึษาว่ามฤีทธยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส ิ์ ได้ดีกว่า acarbose ซึ่งใช้เป็นยารักษาโรคเบาหวาน มะดันมีชื่อวิทยาศาสตร์ว่า Garcinia schomburgkiana Pierre จัดอยู่ในวงศ์มังคุด (Guttiferae) ลักษณะโดยทั่วไปของมะดัน คือ เป็นไม้ยืนต้น ไม่ผลัดใบ สูงประมาณ 7-10 เมตร แตกกิ่งก้านออกเป็น พุ่ม ลักษณะของเปลือกต้นและกิ่งจะเรียบและมีสีน ้าตาลอมด า ใบเป็นใบเดี่ยว สีเขียวเข้ม รูปขอบขนาน ขอบใบเรียบออกเรียงสลับกัน โคนใบและปลายใบแหลม แผ่นใบเรียบลื่น ส่วนดอกมีลักษณะเป็นดอก เดี่ยวหรือกระจุกประมาณ 3-6 ดอก โดยจะออกตามซอกใบ ดอกมีสีเหลืองอมส้ม ลักษณะของผลจะ คล้ายรูปรีปลายแหลมสีเขียว ผิวเรียบเป็นมันลื่น และมีรสเปรี้ยว ด้านในผลมีเมล็ดประมาณ 3-4 เมล็ด ดังแสดง จากข้อภูมิปัญญาการใช้สมุนไพรพื้นบ้านมีรายงานว่ามันดันมีสรรพคุณมากมาย เช่น แก้ไข้หวัด แก้ไข้ทับระดู ขับฟอกโลหิต ขับเสมหะในล าคอ แก้กระษัย แก้ระดูเสีย เป็นยาระบายอ่อน ๆ และแก้ เบาหวานได้ จากการศึกษาทางพฤกษเคมีของมะดันก่อนหน้านี้ได้มีรายงานการค้นพบแซนโทน ไบโอฟลาโว นอยด์ไบฟินิลนิล อนุพันธ์เบนโซฟีนอล คิวโนน และเตียรอยด์ เป็นองค์ประกอบหลัก ตัวอย่างเช่น3 จากการสืบค้นรายงานวิจัยหลายฉบับ พบว่ายังไม่มีรายงานเกี่ยวกับการระบุองค์ประกอบทาง เคมีที่ออกฤทธจาิ์กมะดันเกี่ยวกับคุณสมบัติในการยับยั้งการท างานของเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสมา ก่อน ดังนั้นจุดประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือ การศึกษาองค์ประกอบทางเคมีพรอ้มกบัการทดสอบทธิ์ ยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสและต้านอนุมูลอิสระของสารบรสิุทธทิ์ ่แียกได้จากมะดนั นอกจากนี้ยัง รวมถึงการศึกษาเชิงจลนศาสตร์ของเอนไซม์และโมเลกุลลาร์ด็อกกิ้งของสารที่มีศักยภาพในการยับยั้ง เอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดสเพื่อจะได้เขา้ใจถงึโหมดการออกฤทธระหว่า ิ์งสารออกฤทธกับเอนไซม์แอลฟา ิ์ กลูโคซิเดสอย่างแท้จริง วัตถุประสงค์ เพื่อศึกษาองค์ประกอบทางเคมีและหาสารที่มีศักยภาพในการยับยั้งเอนไซม์แอลฟากลูโคซิเดส และต้านอนุมูลอิสระจากมะดัน รวมถึงการศึกษาเชิงจลนศาสตร์ของเอนไซม์และโมเลกุลลาร์ด็อกกิ้งของ สารทม่ีฤีทธิ์ วิธีทดลอง การเตรียมสารสกัดหยาบจากเปลือกต้นและกิ่งมะดัน น าผงตัวอย่างที่บดละเอียดของเปลือกต้นและกิ่งมะดัน อย่างละประมาณ 20 กิโลกรัม มาสกัด สารส าคัญด้วยตัวท าละลายเอทานอล หลังจากนั้นระเหยตัวท าลายเอทานอลออกด้วยเครื่องระเหยแบบ สุญญากาศ (rotary evaporator) จะได้สารสกัดหยาบเอทานอลออกมา4 การแยกสารบริสทุธ์ิจากสารสกดัหยาบ น าสารสกดัหยาบเอทานอลท่ไีด้มาแยกสารบรสิุทธดิ์้วยวธิทีางโครมาโทกราฟีท่เีหมาะสม เช่น โครมาโทกราฟีแบบผิวบาง (TLC), คอลัมน์โครมาโทกราฟี (column chromatography) หรือเทคนิคอื่น ๆ ดังแสดง การพิสจูน์โครงสร้างทางเคมีของสารบริสทุธ์ิที่แยกได้ หลงัจากแยกสารบรสิุทธไิ์ดแ้ลว้จะท าการพสิูจน์โครงสรา้งทางเคมขีองสารทแ่ียกไดด้ ้วยเทคนิค ทางสเปกโทสโกปี เช่น นิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์สเปกโทรสโคปี(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR), แมสสเปกโทรเมทรี (Mass spectrometry, MS) และอินฟราเรดสเปกโทรสโคปี (Infrared spectroscopy, IR) เป็นต้น5 การทดสอบฤทธ์ิต้านอนุมลูอิสระ 2,2 -Diphenyl-1-picryhydrazyl radical (DPPH) การทดสอบฤทธ์ิต้านอนุมลูอิสระ (DPPH) เบือ้งต้น ด้วยวิธีTLC 1. เตรียมสารละลาย 0.2% DPPH ในเมทานอล 2. จุดสารตัวอย่างและสารมาตรฐาน (ascorbic acid) บนแผ่น TLC จากนั้นจุ่มแผ่น TLC ลงในภาชนะที่อิ่มไปด้วยตัวท าละลาย เพื่อชะให้สารเคลื่อนที่ไปตามแผ่น TLC จนกระทั่งตัวท าละลาย เคลื่อนที่มาถึงเส้นที่ก าหนดไว้ แล้วยกออก 3. พ่นแผ่น TLC ด้วย 0.2% DPPH ในเมทานอล จนเป็นสีม่วงทั่วแผ่น 4. สังเกตจุดสีเหลืองที่ปรากฏขึ้นและหากสารไหนปรากฏจุดสีเหลือง แสดงว่าสารนั้นมี ฤทธติ์า้นอนุมลูอสิระเบอ้ืงตน้ การทดสอบฤทธ์ิต้านอนุมลูอิสระ (DPPH) ด้วยวิธีspectrophotometry assay หลงัจากทท่ี าการทดสอบฤทธติ์้านอนุมลูอสิระเบ้อืงต้นแลว้ ใหน้ าสารสกดัหรอืสารบรสิุทธิ์ ท่ีมีฤทธิต์้านอนุมูลอิสระเบ้ืองต้นมาท าการทดสอบฤทธิต์้านอนุมูลอิสระด้วยวิธีspectrophotometry assay เพื่อหาค่า % radical scavenging และ IC50 มีวิธีการทดลองดังนี้ 1. เตรียมสารละลายตัวอย่างและสารมาตรฐาน (ascorbic acid) ให้มีความเข้มข้น 10 ความเข้มข้น ได้แก่ 0, 3.91 x 10-3 , 7.81 x 10-3 , 1.56 x 10-2 , 3.13 x 10-2 , 0.0625 และ 0.125 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ตามล าดับ 2. เต รียมสารละลาย 0.3 mM DPPH ใน เมท าน อล โด ยชั่งสาร 2,2-diphenyl-1- picryhydrazyl radical (DPPH) ประมาณ 5.92 มิลลิกรัม ละลายในเมทานอล 50 มิลลิลิตร 3. ปิเปตสารละลายตัวอย่างและสารละลายมาตรฐานความเข้มข้นละ 50 µL ลงในช่องของ microplate ความเข้มข้นละ 3 ช่อง 4. เติมสารละลาย 0.3 mM DPPH ในเมทานอล ลงไป 200 µL 5. เขย่าให้เข้ากันและตั้งทิ้งไว้ในที่มืดประมาณ 30 นาที 6. น า 96 well plate ไปวัดค่าการดูดกลืนคลื่นแสงที่ 517 นาโนเมตร 7. ค านวณ % radical scavenging จากสมการ % radical scavenging = (1-(Asample / Acontrol)) x 100 เมื่อ Asample = ค่า absorbance ที่วัดได้ของสารละลายที่ผสม DPPH แล้ว Acontrol = ค่า absorbance ที่วัดได้ของตัวท าละลายที่ใช้ผสมกับ DPPH ในการรายงานค่าจะรายงานค่าเป็น IC50 (The half maximal inhibitory concentration) ซึ่งได้ จากการสร้างกราฟแสดงความสัมพันธ์ระหว่าง % radical scavenging กับความเข้มข้น ซึ่งความเข้มข้น