ratchadaporn9%2C+%7B%24userGroup%7D%2C+8.+%E0%B8%99%E0%B8%B4%E0%B8%AA%E0%B8%B2++%E0%B8%A3%E0%B9%88%E0%B8%A1%E0%B8%AA%E0%B9%89%E0%B8%A1%E0%B8%8B%E0%B9%88%E0%B8%B2+%28edit%29

76 | Vol. 14 No. 1, January – April 2021 Naresuan Phayao Journal บทความวิจยั(Research Article) คณุสมบตัิทางชีวภาพของผลิตภณัฑค ์ อมบชูาที่เกิดขึน้ ในระหว่างกระบวนการหมัก นิสา ร่มส้มซ่า1* , จุฑามาศ พรสันเทียะ1 , ทิพย์วรินทร์ ริมล าดวน1 และ กุณฑิกา เวชกลาง1 The biological activities of Kombucha duringFermentation Process Nisa Romsomsa1* , Juthamat Pornsanthia1 , Thipwarin Rimlumduan1 and Kunthika Vechklang1 1 Department of Applied Biology, Faculty of Sciences and Liberal Arts, Rajamangala University of Technology Isan Nakhonratchasima, Nakhonratchasima 30000 * Correspondence to: [email protected] Naresuan Phayao J. 2020;14(1): 75-87. Received; 5 October 2020; Revised: 6 January 2021; Accepted: 19 April 2021 บทคดัย่อ วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อศึกษาคุณสมบัติทางชีวภาพของคอมบูชาที่ได้จากกระบวนการหมัก โดย ท าการทดสอบคุณสมบัติทางชีวภาพที่มีประโยชน์ในผลิตภัณฑ์คอมบูชา ได้แก่ ปริมาณแบคทีเรียกรดอะซิติก และยีสต์ ฤทธติ์า้นอนุมลูอสิระ ปริมาณฟีนอลิครวม และฤทธยิ์บัยงั้แบคทเรีย ท าการทดสอบในระหว่างการหมักคอม ี บูชาตั้งแต่เริ่มกระบวนการหมักถึงวันที่ 14 ของการหมัก พบว่ายีสต์และแบคทีเรียกรดอะซิติกมีปริมาณเซลล์เพิ่มขึ้น ตามระยะเวลาการหมักโดยยีสต์มีปริมาณสูงสุด เท่ากับ 5.44±0.09 log CFU/mL ในวันที่ 10 ของการหมัก ในขณะที่ ปริมาณแบคทีเรียกรดอะซิติกมีปริมาณเท่ากับ 5.27±0.05 log CFU/mL ในวันที่ 14 ของการหมัก กรดอะซิติกมีปริมาณ ที่เพิ่มขึ้นตามระยะเวลาของการหมักโดยมีปริมาณ 0.74±0.03 กรัมต่อ 100 มิลลิลิตร และพีเอชมีค่าที่ลดลงเท่ากับ 3.14 ร่วมกับพบปริมาณแอลกอฮอล์เท่ากับร้อยละ 0.5 โดยปริมาตรในวันที่ 14 ของการหมัก นอกจากนี้ปริมาณน ้าตาล รีดิวซ์เท่ากับ 6.57±0.012 กรมัต่อลติรในวนัเดยีวกนัผลการทดสอบฤทธยิ์บัยงั้แบคทเีรยี Bacillus subtilis, B. cereus, Salmonella sp., Stayphylococcus aureus และ Escherichia coli ด้วยวิธี Agar well diffusion พบว่าตัวอย่างคอมบูชา มฤีทธยิ์บัยงั้แบคทเีรยีเพมิ่มากขน้ึตามระยะเวลาการหมกั โดยตวัอย่างคอมบชูาในวนัท่ี14 ของการหมัก มีค่าดัชนีการ ยับยั้งแบคทีเรีย (Antibacterial index, AI) เท่ากับ 0.93±0.10 1.49±0.17 1.30±0.10 0.98±0.10 และ 1.12±0.24 ตามล าดบัผลการวิเคราะห์ฤทธิต์้านอนุมูลอิสระด้วยวิธีDPPH พบว่าค่าร้อยละ Scavenging activity เพิ่มขึ้นตาม ระยะเวลาการหมัก โดยมีค่าร้อยละ Scavenging activity เท่ากับ 57.31±0.66 เปอร์เซ็นต์ (เทียบกับ ascorbic acid 254.99 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) ในวันที่ 14 ของการหมัก ขณะที่การวิเคราะห์ด้วยวิธี ABTS ในตัวอย่างวันเดียวกัน พบความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระเท่ากับ 15.66±0.15 มิลลิโมลลาร์เทียบกับสารละลายโทรล็อก นอกจากนี้ยังพบ ปริมาณฟีนอลิกรวม เท่ากับ 0.99±0.04 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้นในกระบวนการหมักคอมบูชาที่มี คุณสมบตัิทางชีวภาพท่ีเป็นประโยชน์ต่อสุขภาพโดยมฤีทธติ์้านอนุมูลอสิระและฤทธิย์บัยงั้แบคทีเรยีท่ีเพิ่มข้นึตาม ระยะเวลาการหมักเมื่อเทียบกับชาด า ค าส าคัญ: คอมบูชา, ยีสต์, แบคทีเรียกรดอะซิติก, ฤทธติ์า้นอนุมลูอสิระ, ฤทธยิ์บัยงั้แบคทเีรยี 1 สาขาชีววิทยาประยุกต์ คณะวิทยาศาสตร์และศิลปศาสตร์ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน นครราชสีมา จังหวัดนครราชสีมา 30000Naresuan Phayao Journal Vol. 14 No. 1, January – April 2021 | 77 Abstract Aim of this research is to evaluate the biological activities of Kombucha during fermentation process and determined potential benefits of kombucha product, including the viable counts of acetic acid bacteria and yeasts, antioxidant activity, total phenolic contents and antibacterial activity were investigated. The brewing kombucha for 14 days was studied. The results show that yeast cells drastically increased withthin 10 days lead to the growth of 5.40±0.09 log CFU/mL while acetic acid bacteria increased of 5.27±0.05 log CFU/mL withthin 14 days was observed. According to acetic acid production has increased to 0.74±0.03 g/100 mL and reduces the pH at 3.14. The ethanol content of the kombucha was 0.5 % by volume and reducing sugar of 6.57±0.01 g/L was found. Antibacterial activity of kombucha in during fermentation process was determined which against Bacillus subtilis, B. cereus, Salmonella sp., Stayphylococcus aureus and Escherichia coli by agar well diffusion method. According to the antibacterial activity of 14 days kombucha brewing, have shown an ability to inhibit the growth of bacteria and also has antimicrobial activity against a spectrum of organism. The maximum activity was founded at 14 days of kombucha fermentation organism against all isolates, the AI value was 0.93±0.10, 1.49±0.17, 1.30±0.10, 0.98±0.10 and 1.12±0.24, respectively. The antioxidant activity was determined using the DPPH and ABTS methods. Kombucha samples exhibited increasing antioxidant activity during in the fermentation process. The 14 days of kombucha sample showed highest antioxidant activity by inhibiting 57.31±0.66 % of DPPH (equivalent to ascorbic acid 254.99 µg/mL) and showed 15.66±0.15 mM Trolox Equivalent Antioxidative Capacity for ABTS assay. Remarkable high phenolic content was found in 14 days kombucha brewing 0.99±0.04 mg gallic acid equivalents per milliliter. The result of present study revealed that kombucha could be the potential health benefit as antioxidant and antimicrobial activities which were increased with time of fermentation and demonstrated a higher activity compared to black tea. Keywords: Kombucha, Yeast, Acetic acid bacteria, Antioxidant activity, Antibacterial activity บทน า สภาพสังคมปัจจุบันมีความเปลี่ยนแปลงใน ลักษณะเป็นสังคมที่เร่งรีบในการท างานและการด าเนิน ชีวิตประจ าวัน รวมถึงสภาวะแวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงไป ส่งผลให้ผู้คนนิยมหันมาดูแลสุขภาพกันมากขึ้น ดังนั้น ความต้องการผลิตภัณฑ์ที่ช่วยเสริมสร้างสุขภาพให้ ร่างกายมีระบบภูมิคุ้มกันที่แข็งแรงจึงมีแนวโน้ม มากขึ้น โดยปัจจุบันผลิตภัณฑ์อาหารเพื่อสุขภาพได้ ถูกพัฒนาขึ้นอย่างแพร่หลายในด้านวัตถุดิบจาก ธรรมชาติ กระบวนการผลิต รูปแบบและรสชาติของ ผลิตภัณฑ์ เพื่อตอบสนองความต้องการของผู้บริโภค นอกจากอาหารเพื่อสุขภาพแล้วความต้องการ ผลิตภัณฑ์เครื่องดื่มเพื่อสุขภาพมีแนวโน้มสูงขึ้น ซึ่ง ผู้บริโภคหันมาให้ความสนใจรับประทานเครื่องดื่มเพื่อ สุขภาพจากธรรมชาติมากขึ้นโดยเฉพาะเครื่องดื่มที่มี สารต้านอนุมูลอิสระ (Antioxidant) การต้านเชื้อจุลินทรีย์ (Antimicrobial activity) ต้านการอักเสบ รวมไปถึงเป็น สารต้านการก่อมะเร็ง [1] ชาหมัก หรือ Kombucha คือเครื่องดื่มที่น า เอาใบชาด า ชาเขียว หรือใบชาอื่นๆ มาหมักกับน ้าตาล และหัวเชื้อแบคทีเรียและยีสต์ Symbiotic Culture of Bacteria and Yeast หรือเรียกว่า“SCOBY” เกิดเป็น เซลลูโลสที่มีลักษณะคล้ายเยลลี่อยู่ด้านบน เพื่อให้เกิด กระบวนการหมักชาอย่างน้อย 1สัปดาห์ จนออกมาเป็น เครื่องดื่มที่มีรสชาติหวานอมเปรี้ยว มีกลิ่นแอลกอฮอล์ เล็กน้อย เนื่องจากส่วนผสมหลักเป็นกรดน ้าส้ม (Acetic Acid) ประโยชน์ของเครื่องดื่มชาหมักช่วยส่งเสริมระบบ ภูมิคุ้มกัน เนื่องจากมีสารต้านอนุมูลอิสระในปริมาณที่สูง มีจุลินทรีย์ที่เป็นโปรไบโอติกส์ (Probiotics) เนื่องด้วย78 | Vol. 14 No. 1, January – April 2021 Naresuan Phayao Journal ชาหมักมีกรดน ้าส้มหรือกรดอะซิติกเป็นส่วนประกอบ หลัก จึงมีคุณสมบัติช่วยก าจัดเชื้อจุลินทรีย์ที่เป็ น อันตรายต่อร่างกาย นอกจากนี้คุณสมบัติของชาหมัก ยังช่วยลดความเสี่ยงโรคหัวใจและหลอดเลือดลดความ เสี่ยงโรคมะเร็ง ลดระดับน ้าตาลในเลือด เป็นต้น [2-4] ดังนั้นการศึกษาคุณสมบัติทางชีวภาพของผลิตภัณฑ์ที่ เกิดขึ้นในระหว่างกระบวนการหมักคอมบูชาที่เป็น ประโยชน์ของผลิตภัณฑ์คอมบูชา ท าให้ทราบถึงระยะ เวลาที่เหมาะสมในการหมักคอมบูชาเพื่อให้ได้สารออก ฤทธิท์างชีวภาพสูงสุด จะเป็นข้อมูลพื้นฐานที่เป็น ประโยชน์ส าหรับเป็ นแนวทางศึกษาการพัฒนา เครื่องดื่มคอมบูชาเพื่อสุขภาพให้เป็นที่ยอมรับของ ผู้บริโภคต่อไป วสัดแุละวิธีการ การหมักคอมบูชา ต้มน ้าปริมาตร 3 ลิตร ให้เดือดแล้วยกลงจาก เตา จากนั้นเติมน ้าตาลทราย 165 กรัม คนจนน ้าตาล ละลายแล้วใส่ชาด าทางการค้า 12 กรัม ตั้งทิ้งไว้ 15 นาที จากนั้นใส่หัวเชื้อคอมบูชาทางการค้า (Scoby) ปริมาณร้อยละ 20 (v/v) ปิดฝาโหลด้วยผ้าขาวบางมัด ด้วยยาง บ่มที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นระยะเวลา 14 วัน จากนั้นน ามากรองแล้วบรรจุใส่ภาชนะและแช่เย็นที่ อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ศึกษาปริมาณแบคทีเรยีกรดอะซิติกและยีสต์ ศึกษาปริมาณของเชื้อแบคทีเรียกรดอะซิติก และยีสต์ ปริมาณกรดอะซิติก ค่าพีเอช ปริมาณ แอลกอฮอล์และปริมาณน ้าตาลรีดิวซ์จากตัวอย่างคอม บูชาที่ระยะเวลาตั้งแต่วันเริ่มต้นของการหมัก(0) 3 7 10 และ 14 วัน โดยวัดปริมาณแบคทีเรียกรดอะซิติก และยีสต์ใช้เทคนิค Spread Plate บนอาหาร Glucose Yeast extract Calcium carbonate agar (GYC agar) (HiMedia Laboratories, India) แ ล ะอ าห าร Yeast Extract Peptone Dextrose agar (YEPD agar) (HiMedia Laboratories, India) ต า ม ล า ดั บ บ่ ม ที่ อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง ตรวจนับจ านวนโคโลนี และมาค านวณรายงานเป็นค่า log CFU/mL วิเคราะห์ปริมาณแอลกอฮอล์ด้วยเครื่อง อีบูลลิโอมิเตอร์ (Ebulliometer) โดยใช้จุดเดือดของน ้า เป็นชุดควบคุม วิเคราะห์ปริมาณน ้าตาลรีดิวซ์ด้วยวิธี 3, 5 -Dinitrosalicylic Acid (DNS) (Sigma-aldrich, Germany) [5] และวิเคราะห์ปริมาณกรดอะซิติกโดย วิธีการไตเตรต [6] วิเคราะหฤ์ทธ์ิต้านอนุมลูอิสระของคอม บูชาด้วยวิธีDPPH radical scavenging activity วเิคราะหฤ์ทธติ์านอนุมูลอิสระต้านอนุมูลอิสระ ้ ดัดแปลงวิธีของ Lu และคณะ [7] โดยเตรียมสารละลาย 2, 2 diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-aldrich, Germany) ที่ความเข้มข้น 40 มิลลิกรัมต่อลิตร โดย เจือจางในเอทานอล แล้วน ามาปรับให้มีค่าดูดกลืนแสง ที่ 515 นาโนเมตร เท่ากับ 0.9 จากนั้นน าตัวอย่าง คอมบูชาที่ระยะเวลาตั้งแต่วันเริ่มต้นของการหมัก(0) 3 7 10 และ 14 วนัมาวิเคราะห์ฤทธติ์้านอนุมูลอสิระ ต้านอนุมูลอิสระโดยน าตัวอย่างคอมบูชามาเจือจาง 20 เท่า แล้วปิเปตในปริมาตร 50 ไมโครลิตร เติมลงใน สารละลาย DPPH ที่มีปริมาตร 1.950 มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิห้อง 30 นาที จากนั้นวัดค่าการดูดกลืน แสงที่ความยาวคลื่น 515 นาโนเมตร ชุดควบคุมใน การทดลองใช้เอทานอล 50 ไมโครลิตร แทนตัวอย่าง คอมบูชา เนื่องจากคอมบูชาที่ได้อาจมีสีจึงต้องน า ตัวอย่างคอมบูชาที่เจือจางที่ความเข้มข้นดังกล่าวใน ปริมาตร 50 ไมโครลิตร เติมลงเอทานอลที่มีปริมาตร 1.950 มิลลิลิตร ไว้ส าหรับเป็ นหลอดอ้างอิงของ ตัวอย่างคอมบูชาที่มีสีที่ใช้ในการทดสอบ (BS) มีไว้ เพื่อหักออกจากค่าการดูดกลืนแสงของคอมบูชา การ ทดลองนี้ใช้ Ascorbic acid เป็นสารละลายมาตรฐาน ค านวณหาร้อยละ Scavenging activity จากสมการ ร้อยละ Scavenging activity = ( ) 100 ( )  − − control control sample A A A BS แสดงในหน่วยความเข้มข้นของ Ascorbic Acid เป็นสารมาตรฐานNaresuan Phayao Journal Vol. 14 No. 1, January – April 2021 | 79 วิเคราะหฤ์ทธ์ิต้านอนุมลูอิสระของคอม บูชาด้วยวิธีABTS radical scavenging activity น าตัวอย่างคอมบูชาที่ระยะเวลาตั้งแต่วัน เริ่มต้นของการหมัก(0)3 7 10และ 14 วัน มาวิเคราะห์ ฤทธิต์ ้านอนุมูลอิสระต้านอนุมูลอิสระตามวิธีของ Wiriyaphan และคณะ [8] โดยปิเปตตัวอย่างคอมบูชา 20 ไมโครลิตร ท าปฏิกิริยากับสารละลายอนุมูลอิสระ 2,2′-Azino-bis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid) (ABTS) (Sigma-aldrich, Germany) ปริมาณ 1,980 ไมโครลิตร น าไป Vortex ทิ้งไว้ในที่มืด 5 นาที จากนั้น วัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 734 นาโนเมตร เปรียบเทียบกับสารละลายมาตรฐาน Trolox (Sigmaaldrich, Germany) ที่ความเข้มข้น 0 0.5 1.0 1.5 2.0 และ 2.5 มิลลิโมลาร์ การวิเคราะหป์ริมาณฟีนอลิกรวม น าตัวอย่างคอมบูชาที่ระยะเวลาตั้งแต่วัน เริ่มต้นของการหมัก (0) 3 7 10 และ 14 วัน มา วิเคราะห์ปริมาณฟีนอลิกรวมตามวิธีของ Matthäus และคณะ [9] น าตัวอย่างคอมบูชามาเจือจางด้วยน ้า กลั่นในอัตราส่วนที่เหมาะสม ปิเปตตัวอย่างปริมาตร 50 ไมโครลิตรจากนั้นเติม 2 % Na2CO3 ปริมาตร 2 มิลลิลิตร ทิ้งไว้ 2 นาที เติม Folin Ciocalteu Reagent (Carlo Erba Chemicals, Italy) (Folin Ciocalteu Reagent: Methanol (RCI Labscan, Ireland) อัตราส่วน 1:1) ปริมาตร 100 ไมโครลิตร บ่มที่มืด 30 นาที แล้วน าไปวัดค่าการดูดแสงที่ความยาวคลื่น 750 นาโนเมตร โดยท าการทดลอง 3 ซ ้า จากนั้นน าไปค านวณ หา ปริมาณสารฟี นอลิกทั้งหมดจากกราฟมาตรฐาน ปริมาณกรดแกลลิก (HiMedia Laboratories, India) การวิเคราะหฤ์ทธ์ิยบัยงั้แบคทีเรียของ คอมบูชา วิเคราะห์ฤทธิก์ารยับยั้งการเจริญของ แบคทีเรียด้วยวิธี Agar Well Diffusion ตามวิธีของ Mayo [10] โดยใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ LB agar (HiMedia Laboratories, India) ซึ่งใช้เชื้อทดสอบ ได้แก่ Bacillus subtilis TISTR 1528, Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococus aureus ATCC 25923, Escherichia coli TISTR 117 แ ล ะ Salmonella typhimurium ATCC 13311 ท าการเพาะเลี้ยงเชื้อทดสอบดังกล่าวใน อาหาร LB medium (HiMedia Laboratories, India) บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเตรียมสารละลายเซลล์ของเชื้อทดสอบมาปรับ ปริมาณโดยเทียบกับ McFarland No. 0.5 ซึ่งเท่ากับ 107 CFU/mL จากนั้นน าสารละลายเซลล์ของเชื้อ ทดสอบ Swab เชื้อทดสอบ ลงบนอาหาร LB เจาะหลุม วุ้นด้วย cork borer แล้ว ปิเปตตัวอย่างคอมบูชาที่ ระยะเวลาตั้งแต่วันเริ่มต้นของการหมัก(0) 3 7 10 และ 14 วัน ตัวอย่างละ 100 ไมโครลิตร ลงในหลุมอาหาร เลี้ยงเชื้อ บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และค านวณค่าดัชนีการยับยั้งแบคทีเรีย (Antibacterial index, AI) [11] ดังนี้ Antibacterial index (AI) = เส้นผ่านศูนย์กลางของบริเวณโซนใส-เส้นผ่านศูนย์กลางของหลุม เส้นผ่านศูนย์กลางของหลุม วิเคราะหค์ณุภาพทางจลุินทรียข์องคอมบูชา น าตัวอย่างคอมบูชามาวิเคราะห์คุณภาพทาง จุลชีววิทยาตามเกณฑ์คุณภาพทางจุลชีววิทยาของ อาหารและภาชนะสัมผัสอาหาร ฉบับที่ 3 (2560) ประเภทเครื่องดื่มที่ไม่ได้บรรจุในภาชนะปิดสนิท โดย น าตัวอย่างคอมบูชาปริมาณ 25 มิลลิลิตรมา ตรวจ วิเคราะห์เชื้อแบคทีเรียก่อโรคในอาหารตามวิธี Bacteriological Analytical Manual (BAM) ดั ง นี้ คื อ วิเคราะห์เชื้อ S. aureus ลงบนอาหาร Baird-Parker agar [12] ตรวจวิเคราะห์เชื้อ Salmonella sp. ใน อาหาร Lactose broth [13] ตรวจวิเคราะห์เชื้อ E. coli โดยวิธี MPN [14] และตรวจวิเคราะห์เชื้อ B. cereus ลงบนอาหาร Mannitol-egg yolk-polymyxin (MYP) agar [15]80 | Vol. 14 No. 1, January – April 2021 Naresuan Phayao Journal วิเคราะหท์างสถิติ น าข้อมูลมาวิเคราะห์ค่าความแปรปรวน (analysis of variance, ANOVA) และเปรียบเทียบ ความแตกต่างระหว่างกลุ่มโดยใช้ Duncan’s multiple range test โดย โป รแ กรม วิเคราะห์สถิติSPSS software program version 12.0 ผลการศึกษา การตรวจวิเคราะห์ปริมาณแบคทีเรียกรดอะ ซิติกและยีสต์ในกระบวนการหมักชาคอมบูชา แสดงดัง ภาพ 1 โดยตัวอย่างคอมบูชาในระยะเวลาเริ่มต้นของ การหมัก (วันที่ 0) มีปริมาณยีสต์เท่ากับ 3.27±0.13 log CFU/mL และมีปริมาณเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วเท่ากับ 4.93±0.06 log CFU/mL ในวันที่ 3 และมีปริมาณ สูงสุดในวันที่ 10 ของการหมักเท่ากับ 5.44±0.09 log CFU/mL จากนั้นปริมาณยีสต์มีค่าลดลงในวันที่ 14 ของการหมัก โดยมีปริมาณเซลล์เท่ากับ 2.70±0.12 log CFU/mL จากกระบวนการหมักคอมบูชา เกิดสร้าง เซลลูโลสสะสมบริเวณผิวหน้าของของคอมบูชา โดยลักษณะของแผ่นเซลลูโลสที่ได้มีลักษณะสีขาว ค่อนข้างขุ่น (ภาพ 2A และ2B) ผลการวิเคราะห์ ปริมาณแบคทีเรียกรดอะซิติกจากแผ่นเซลลูโลสพบ แบคทีเรียกรดอะซิติกลักษณะโคโลนีกลมโดยโคโลนีที่ ขึ้นบนอาหารเลี้ยงเชื้อ GYC มีการสร้างโซนใสรอบ โคโลนี(ภาพ 2C) โดยไม่พบแบคทีเรียกรดอะซิติก ตั้งแต่วันเริ่มต้นของการหมัก วันที่ 3 และ 7 แต่ตรวจ พบปริมาณแบคทีเรียกรดอะซิติกจากแผ่นเซลลูโลส เท่ากับ 4.85±0.06 log CFU/mL ของการหมักในวันที่ 10 และมีปริมาณเท่ากับ 5.27±0.05 log CFU/mL ใน วันที่ 14 ของกระบวนการหมักคอมบูชา ปริมาณ กรดอะซิติกในตัวอย่างคอมบูชาเริ่มต้นของการหมัก เท่ากับ 0.32±0.03 กรัมต่อตัวอย่าง 100 มิลลิลิตร และมีปริมาณเพิ่มขึ้นเมื่อระยะเวลาการหมักผ่านไป โดยพบปริมาณกรดอะซิติกสูงสุดในวันที่ 14 ของการ หมักเท่ากับ 0.74±0.03 กรัมต่อตัวอย่าง 100 มิลลิลิตร ซึ่งสอดคล้องกับค่าพีเอช โดยค่าพีเอชเริ่มต้นเท่ากับ 3.43 และมีค่าพีเอชวันที่ 14 ของการหมักเท่ากับ 3.14 ปริมาณแอลกอฮอล์จากตัวอย่างคอมบูชาในวันที่ 14 ของการหมักเท่ากับร้อยละ 0.5 ส่วนปริมาณน ้าตาล รีดิวซ์ของตัวอย่างคอมบูชาเริ่มต้นเท่ากับ 8.41±0.07 กรัมต่อลิตร และมีแนวโน้มลดลง เมื่อระยะเวลาการ หมักในวันที่ 14 ปริมาณน ้าตาลรีดิวซ์ของตัวอย่างคอม บูชาเท่ากับ 6.57±0.12 กรัมต่อลิตร Time (Days) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Yeast (log CFU/mL) 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Acetic acid bacteria (log CFU/mL) 1 2 3 4 5 6 Acetic acid (g/100mL) .2 .3 .4 .5 .6 .7 .8 Alcohol (%) 0.0 .5 1.0 1.5 2.0 pH 3.10 3.15 3.20 3.25 3.30 3.35 3.40 3.45 Reducing sugar (g/L) 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 yeast log CFU/mL Acetic acid bacteria (log CFU/mL) Acetic acid Alcohol (%) pH Reducing sugar (g/L) ภาพ 1 ความสัมพันธ์ของแบคทีเรียกรดอะซิติกและยีสต์ในกระบวนการหมักคอมบูชาNaresuan Phayao Journal Vol. 14 No. 1, January – April 2021 | 81 ภาพ 2 ลักษณะของแผ่นเซลลูโลสในกระบวนการหมักคอมบูชา A) ลักษณะของแผ่นชั้นเซลลูโลส B) ลักษณะของแผ่นเซลลูโลส C) แบคทีเรียกรดอะซิติก ผลการวิเคราะห์ฤทธิต์ ้านอนุมูลอิสระของ คอมบูชาด้วยวิธี DPPH พบว่า ค่าร้อยละ Scavenging activity ของตัวอย่างคอมบูชาเพิ่มขึ้นตามระยะเวลา การหมัก โดยมีค่าร้อยละ Scavenging activity เริ่มต้น ของการหมักเท่ากับร้อยละ 52.67±0.51 (เทียบกับ ascorbic acid 234.46 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) และมี ค่าร้อยละ Scavenging activity สูงสุดเท่ากับร้อยละ 57.92±0.18 (เ ที ย บ กั บ ascorbic acid 257.69 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) ในระยะการหมักของวันที่ 10 จากนั้น ค่าร้อยละ Scavenging activity จะลดลง เท่ากับร้อยละ 57.31±0.66 (เทียบกับ ascorbic acid 254.99 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) ตัวอย่างคอมบูชามีค่า ร้อยละ Scavenging activity น้อยกว่าชาด าที่ไม่ได้ ห มัก (59.99±0.32) อ ย่ างมีนั ย ส าคัญ ท างส ถิ ติ (p≤0.05) จากการวิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี ABTS ของคอมบูชาพบว่าปริมาณสารต้านอนุมูลอิสระ ของตัวอย่างคอมบูชาเพิ่มขึ้นตามระยะเวลาของการ หมักอย่างมีนัยส าคัญทางสถิติ (p≤0.5) โดยตัวอย่าง คอมบูชาในวันเริ่มต้นของการหมักมีสารต้านอนุมูล อิสระ เท่ากับ 9.87±0.16 มิลลิโมลาร์และเพิ่มขึ้นสูงสุด เท่ากับ 15.66±0.15 มิลลิโมลาร์เมื่อระยะเวลาการหมัก ผ่านไป 14 วัน เม่อืเปรยีบเทยีบฤทธติ์้านอนุมูลอสิระ กับชาด าที่ไม่ได้หมัก พบมาว่า คอมบูชาตั้งแต่วันที่ 3 ของการหมักจนถึงวันที่ 14 ของการหมัก มีสารต้าน อนุมูลอิสระมากกว่าชาด าที่ไม่ได้หมัก (12.71±0.31 มิลลิโมลาร์) แสดงดังภาพ 3 A B C82 | Vol. 14 No. 1, January – April 2021 Naresuan Phayao Journal Time(Day) 0 5 10 15 20 % Scarvenging activity (DPPH) 0 10 20 30 40 50 60 70 Antioxidant activity (mM) (ABTS) 0 20 40 60 %Scarvenging activity Antioxidant activity (mM) ภาพ 3 ฤทธติ์า้นอนุมลูอสิระของคอมบชูาทร่ีะยะเวลาการหมกัต่างๆ ดว้ยวธิีDPPH และ ABTS หมายเหตุ: ตัวอักษรa-f ที่ต่างกันของแต่ละกราฟ มีความแตกต่างกันในทางสถิติ (p≤0.05) ผลการวิเคราะห์ปริมาณฟีนอลิกรวมของคอม บูชาพบว่ามีปริมาณฟีนอลิกรวมของตัวอย่างคอมบูชา มากที่สุดในวันเริ่มต้นของการหมัก เท่ากับ 1.54±0.04 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และลดลงในวันที่ 3 เท่ากับ 0.97±0.03 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร จากนั้นเริ่มมีปริมาณ ฟีนอลิกเพิ่มขึ้นเล็กน้อยตามระยะเวลาการหมัก โดย ปริมาณฟีนอลิกของการหมักคอมบูชาวันที่ 14 เท่ากับ 0.99±0.04 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร เมื่อเปรียบเทียบ ปริมาณ ฟี นอลิก ชาด าที่ไม่ได้หมัก (1.53±0.05 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร) จะเห็นได้ว่าปริมาณฟีนอลิกใน คอมบูชามีความแตกต่างกันอย่างมีนัยส าคัญทางสถิติ (p≤0.05) แสดงดังภาพ 4 ตามระยะเวลาการหมัก 52.67±0.51c 54.60±0.53c 0 3 7 10 14 ชาด า 59.99±0.32a 57.31±0.66b 57.92±0.18b 57.11±0.35b 12.71±0.31c 15.66±0.15a 15.19±0.07b 14.72±0.06c 14.14±0.13d 9.87±0.16fNaresuan Phayao Journal Vol. 14 No. 1, January – April 2021 | 83 ภาพ 4 ปริมาณฟีนอลิกรวมของคอมบูชาที่ระยะเวลาการหมักต่างๆ ผลการศึกษาฤทธิก์ารยับยัง้แบคทีเรียของ ค อ ม บู ช า โด ย ท ด ส อ บ กับ เชื้ อ คื อ B. subtilis, B. cereus, Salmonella sp., S. aureus แ ล ะ E. coli ด้วยวิธี Agar well diffusion พบว่า ตัวอย่างคอมบูชา ของวันเริ่มต้นของการหมัก (วันที่0) และตัวอย่างคอม บูชาวันที่ 3 ของการหมัก มีความสามารถในการยับยั้ง เชื้อ B. subtilis และ B. cereus โดยมีค่าดัชนีการ ยับยั้งแบคทีเรีย (AI) ของคอมบูชาวันเริ่มต้นการหมัก เท่ ากับ 0.24±0.16 และ 1.00±0.38 ตามล าดับ ตัวอย่างคอมบูชาในวันที่ 3 ของการหมัก เท่ากับ 0.41±0.06 และ 0.90±0.16 ตามล าดับ แต่ไม่สามารถ ยับยั้งเชื้อ Salmonella sp. S. aureus และ E. coli ได้ ตัวอย่างคอมบูชาของวันที่ 7 ของการหมัก สามารถ ยับยั้งเชื้อได้เพิ่มขึ้นจากวันที่ 0 และ 3 คือเชื้อ Salmonella sp.และ S. aureus แต่ไม่สามารถยับยั้ง E.coli ได้ คอมบูชาวันที่ 10 และ 14 สามารถยับยั้งเชื้อ ทดสอบทั้งหมดได้ โดยมีค่าดัชนีการยับยั้งแบคทีเรีย เท่ากับ 0.93±0.10 1.49±0.17 1.30±0.10 0.98±0.10 และ 1.12±0.24 ตามล าดับ เมื่อเปรียบเทียบกับชาด า พบว่าไม่สามารถยังยั้งเชื้อจุลินทรีย์ทดสอบได้ ข้อมูลที่ ได้จากการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าผลิตภัณฑ์ที่ได้จาก คอมบูชามีความสามารถในการยับยั้งเชื้อทดสอบและ สามารถยับยั้งได้มากขึ้นตามระยะเวลาของการหมัก ดังแสดงในตาราง 1 และภาพ 5 ตาราง 1 ค่าดัชนีการยับยั้งแบคทีเรีย (Antibacterial index, AI) ของตัวอย่างคอมบูชา ระยะเวลา การหมัก คอมบูชา (วัน) ค่าดชันีการยบัยงั้แบคทีเรีย (Antibacterial index, AI) B. subtilis TISTR 1528 B. cereus ATCC 11778 S. typhimurium ATCC 13311 S. aureus ATCC 25923 E. coli TISTR 117 0 0.24±0.16 1.00±0.38 ไม่ยับยั้ง ไม่ยับยั้ง ไม่ยับยั้ง 3 0.41±0.06 0.90±0.16 ไม่ยับยั้ง ไม่ยับยั้ง ไม่ยับยั้ง 7 0.70±0.16b 1.15±0.14a 1.06±0.09a 0.59±0.26a ไม่ยับยั้ง 10 0.54±0.05c 1.08±0.16a 0.93±0.11b 0.73±0.23ab 1.20±0.23a 14 0.93±0.10c 1.49±0.17a 1.30±0.10b 0.98±0.10ab 1.12±0.24bc หมายเหตุ: ตัวอักษรa-b ที่ต่างกันตามแนวนอน มีความแตกต่างกันในทางสถิติ (p≤0.05)84 | Vol. 14 No. 1, January – April 2021 Naresuan Phayao Journal ภาพ 5 ฤทธการยับยั้งแบคทีเรียของคอมบูชาที่ระยะเวลา ิ์ 14 วัน: (a) B. subtilis TISTR 1528 (b) B. cereus ATCC 11778 (c) E. coli TISTR 117 (d) S. typhimurium ATCC 13311 (e) S. aureus ATCC 25923 หมายเหตุ: A) Positive control (1%chloramphenicol), B) คอมบูชา ปรับpH เท่ากับ 6, C) Negative control (น ้ากลั่น), D) ชาด า, E) คอมบูชา จากผลการทดลองการวิเคราะห์คุณภาพทาง จุลินทรีย์ของตัวอย่างคอมบูชาพบว่าแต่ละช่วง ระยะเวลาการหมักคอมบูชาตั้งแต่วันที่เริ่มต้นการหมัก (วันที่ 0) จนถึงระยะเวลาการหมัก 14 วัน ไม่พบการ ปนเปื้อนของ S. aureus Salmonella sp. E. coli และ B. cereus ซึ่งเป็นแบคทีเรียก่อโรคในอาหาร ดังนั้น ตัวอย่างคอมบูชาผ่านเกณฑ์คุณภาพมาตราฐาน คุณภาพทางจุลชีววิทยา ดังแสดงในตาราง 2 ตาราง 2 ผลการวิเคราะห์คุณภาพทางจุลชีววิทยาของตัวอย่างคอมบูชา ระยะเวลาการหมัก คอมบูชา (วัน) ชนิดของแบคทีเรียก่อโรคที่ปนเปื้อน S. aureus Salmonella sp. E. coli B. cereus 0 ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ 3 ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ 7 ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ 10 ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ 14 ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ ไม่พบ วิจารณ์ จากการศึกษาคุณสมบัติทางชีวภาพของ ผลิตภัณฑ์ที่ได้ในระหว่างการหมักคอมบูชา จะเห็นได้ ว่าเริ่มต้นของการหมักคอมบูชา ตรวจพบปริมาณยีสต์ เท่ากับ 3.27±0.13 log CFU/mL และมีปริมาณเพิ่มขึ้น อย่างรวดเร็ว ทั้งนี้เนื่องจากน ้าตาลทรายในส่วนประกอบ ของคอมบูชาซึ่งเป็นแหล่งคาร์บอนจะถูกไฮโดรไลซ์ โดยเอนไซม์อินเวอร์เทสจากยีสต์ จากนั้นยีสต์จะใช้ น ้าตาลกลูโคสและฟรุกโทสท าให้ยีสต์เพิ่มปริมาณและ ผลิตเอทานอล [16] ในสภาวะที่มีเอทานอลจะกระตุ้น การเจริญของแบคทีเรียกรดอะซิติกเปลี่ยนกลูโคสให้ เป็นกรดกลูโคนิค และเปลี่ยนฟรุกโตสให้เป็นกรดอะซิติก เมื่อสิ้นสุดกระบวนการหมักจะมีผลิตภัณฑ์สอง ส่วนประกอบด้วย เซลลูโลสซึ่งเป็นผลพลอยได้จาก แบคทีเรียกรดอะซิติกและส่วนน ้าชาหมักคอมบูชา นอกจากนี้ สารประกอบที่ส าคัญในชาหมักคอมบูชา พบว่าเป็นสารอาหารที่มีประโยชน์ต่อร่างกาย อาทิ กรดกลูโคนิค กรดกลูคูโรนิค กรดอะซิติก กรดแลคติก กรดซิตริก กรดโฟลิค และกรดอะมิโน [17, 18] จากนั้นปริมาณยีสต์มีค่าลดลงในวันที่ 14 ของการหมัก เนื่องจากการเจริญของแบคทีเรียกรด อะซิติกที่เพิ่มขึ้นหลังจากวันที่ 10 ของการหมัก โดยใช้ เอทานอลน ามาผลิตกรดอะซิติก ส่งผลให้ค่าพีเอช ลดลงประกอบกับการลดลงของปริมาณน ้าตาลรีดิวซ์ ท าให้สภาวะดังกล่าวไม่เหมาะกับการเจริญของยีสต์ ส่วนแบคทีเรียกรดอะซิติกที่ตรวจพบในตัวอย่างคอม A B C D E A B C D E (b) (c) (a) (d) (e)Naresuan Phayao Journal Vol. 14 No. 1, January – April 2021 | 85 บูชาโดยแบคทีเรียกรดอะซิติกจะอาศัยอยู่ที่ส่วน แผ่นฟิ ล์มบนผิวหน้าคอมบูชาเนื่องจากแบคทีเรีย กรดอะซิติกต้องการออกซิเจนในการเจริญสร้าง แผ่นฟิล์มเซลล์ลูโลส เมื่อทดสอบปริมาณแบคทีเรีย กรดอะซิติกจากแผ่นเซลลูโลส พบแบคทีเรียกรดอะซิติก ลักษณะโคโลนีกลมโดยโคโลนีที่ขึ้นบนอาหารเลี้ยงเชื้อ GYC มีการสร้างโซนใสรอบโคโลนีโดยปริมาณ แบคทีเรียกรดอะซิติกจากแผ่นเซลลูโลส จากการ ตรวจวัดปริมาณในระหว่างการหมักพบว่ามีแนวโน้ม เพิ่มขึ้นตามระยะเวลาของการหมัก ซึ่งแบคทีเรีย กรดอะซิติกจะออกซิไดซ์เอทานอลเกิดเป็นกรดอะซิติก ปริมาณกรดอะซิติก ในตัวอย่างคอมบูชามีปริมาณ เพิ่มขึ้นเมื่อระยะเวลาการหมักผ่านไปโดยพบปริมาณ กรดอะซิติกสูงสุดในวันที่ 14 ของการหมักเท่ากับ 0.74±0.03 กรัมต่อตัวอย่าง 100 มิลลิลิตร ซึ่งปริมาณ ของกรดอะซิติกที่ใกล้เคียงกับงานของ Jayabalan และ คณะ [19] ที่พบว่าปริมาณกรดของการหมักชาเขียว คอมบูชาแบบผสมเป็น 9.5 กรัมต่อลิตร หลังจากการ หมัก 15 วัน และสนธิรัตน์ และคณะ [20] พบว่า ปริมาณกรดของการหมักชาเขียวคอมบูชาแบบผสม เป็น 8.41 กรัมต่อลิตร หลังจากการหมักเป็นเวลา6วัน จากผลการทดลองวิเคราะห์ฤทธติ์้านอนุมูล อิสระของคอมบูชาด้วยวิธี DPPH พบว่า ค่าร้อยละ Scavenging activity ของตัวอย่างคอมบูชาเพิ่มขึ้น ตามระยะเวลาการหมัก โดยมีค่าร้อยละ Scavenging activity สูงสุดเท่ากับ 57.92±0.18 (เทียบกับ ascorbic acid 257.69 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) ในระยะการหมัก ของวันที่ 10 สอดคล้องกับงานวิจัยของ Amarasinghe และคณะ [21] ซ่งึพบว่าฤทธติ์้านอนุมูลอสิระของคอม บูชาเพิ่มขึ้นตามระยะเวลาการหมักอย่างมีนัยส าคัญ ทั้งนี้เนื่องจากการเพิ่มปริมาณของจุลินทรีย์ในคอมบูชา ท าให้สารต้านอนุมูลอิสระของตัวอย่างคอมบูชาเพิ่มขึ้น ตามไปด้วย นอกจากนี้การเปลี่ยนแปลงของปริมาณ จุลินทรีย์หลักในคอมบูชาจากยีสต์เป็ นปริมาณ แบคทีเรียกรดอะซิติกที่เพิ่มขึ้นแทนภายหลังจากวันที่ 7 ของกระบวนการหมัก ส่งผลให้สารต้านอนุมูลอิสระ เพิ่ ม ขึ้ น ต า ม ไ ป ด้ ว ย [22] จ าก นั้น ค่ า ร้อ ย ล ะ Scavenging activity จะลดลง เท่ากับ 57.31±0.66 (เทีย บ กับ ascorbic acid 254.99 ไม โครก รัม ต่ อ มิลลิลิตร) วันที่ 14 ของการหมัก เนื่องจากในสภาวะที่ เป็นกรด phenolic compound จะมีความเสถียรมาก ขึ้นท าให้ยากที่จะปลดปล่อยโปรตรอนเพื่อที่จะไปจับ กับ DPPH ดังนั้น antioxidant activity จึงลดลงวันที่ 14 ส่วนผลการวิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี ABTS ของคอมบูชาพบว่าปริมาณสารต้านอนุมูลอิสระ ของตัวอย่างคอมบูชาเพิ่มขึ้นตามระยะเวลาของการ หมักอย่างมีนัยส าคัญทางสถิติ (p≤0.5) และสารต้าน อนุมูลอิสระของตัวอย่างคอมบูชาเมื่อท าการหมักเป็น ระยะเวลา 14 วันมีสูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับชาด าที่ ไม่ได้หมัก สอดคล้องกับงานวิจัยของ Ivanišová และ คณะ [23] ส าหรับผลการทดลองวิเคราะห์ปริมาณฟีนอ ลิกรวมของคอมบูชาพบว่าปริมาณฟีนอลิกรวมของ ตัวอย่างคอมบูชามีปริมาณลดลงจากวันเริ่มต้นของการ หมักและค่อนข้างคงที่ตลอดระยะเวลาหมัก 14 วัน ทั้งนี้ เนื่ องจากสารโพ ลีฟี น อลใน ใบ ช าอาจถู ก polimerlization เปลี่ยนโครงสร้างของสารให้ใหญ่ขึ้น หรือเปลี่ยนไปไม่อยู่ในกลุ่มของสารโพลีฟีนอลแล้ว การหาสารต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธีฟีนอลิก จึงท าให้พบ สารประกอบฟีนอลิกที่ลดลง [24] จากผลการทดลองศึกษาฤทธิก์ารยับยัง้ แบคทีเรียของคอมบูชา โดยมีเชื้อทดสอบดังนี้คือ B. subtilis, B. cereus, Salmonella sp., S. aureus และ E. coli ด้วยวิธี Agar well diffusion พบว่าฤทธในิ์ การยับยั้งแบคทีเรียของตัวอย่างคอมบูชาจะเพิ่มขึ้น แปรผันตามระยะเวลาการหมัก โดยตัวอย่างคอมบูชา ในวันที่ 14 ของกระบวนการหมักสามารถยับยั้งเชื้อ ทดสอบได้ทั้งหมด โดยมีค่าดัชนีการยับยั้งแบคทีเรีย (Antibacterial index, AI) เ ท่ า กั บ 0.9 3 ± 0 .1 0 1.49±0.17 1.30±0.10 0.98±0.10 และ 1.12±0.24 ตามล าดับ เมื่อเปรียบเทียบกับชาด า พบว่าไม่สามารถ ยังยั้งเชื้อจุลินทรีย์ทดสอบ ทั้งนี้เนื่องจากคอมบูชามี กรดอินทรีย์ที่สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ แบคทีเรียได้โดยเฉพาะกรดอะซิติกจากแบคทีเรีย กรดอะซิติกในคอมบูชา [25-27] ดังนั้นจะเห็นได้ว่า คอมบูชามฤีทธยิ์บัยงั้แบคทเีรยีก่อโรคในระบบทางเดนิ อาหารได้รวมถึงแบคทีเรียที่ก่อโรคในอาหารต่างๆได้ สอดคล้องกับงานวิจัยของ Sreeramulu และคณะ [28] พบว่าคอมบูชาสามารถยับยั้ง Staphylococcus aureus,